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实时荧光定量PCR


    实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative Real-time PCR)是在DNA扩增反应中,以荧光化学物质监测每次PCR循环后目标分子累计扩增量的方法。数据是在扩增过程中收集的,而非在结束之后。在实时荧光定量PCR中,反应以循环中首次监测到目标扩增的时间点为特征,而不是在一定循环次数后目标分子累计的扩增量(图1)。

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图1:扩增曲线

定量分析常见术语

扩增子:PCR过程而产生的DNA短片段。

扩增曲线:根据荧光信号相对于循环数而制作的曲线(图1)。

基线:PCR起始时,荧光信号还未发生变化的几个循环;基线信号的产生是由于测量的偶然误差引起的。

Ct(阈值循环):从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数。

目标模板:需要扩增的DNA或RNA序列

 

    用于序列监测的试剂分为TaqMan方法和SYBR Green I染料试剂两种方法。TaqMan方法通过采用荧光探针,在PCR循环过程中对特定PCR的累计产物进行检测(图2);SYBR Green I染料法则是采用了高度特异性双链DNA结合染料(图3)。TaqMan和SYBR Green I染料法最为重要的区别在于SYBR Green I染料试剂可以检测所有双链DNA,包括非特异性的反应产物。

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图2:TaqMan方法


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图3:SYBR Green I染料法

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