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RNA的提取纯化


    RNA提取分为样本预处理、裂解、提取纯化和检测四个阶段.

    目前,常用的裂解方案包括异硫氰酸胍/苯酚和胍盐/β-巯基乙醇法。①异硫氰酸胍/苯酚法:苯酚可以裂解细胞,使细胞中的蛋白变性、核酸物质解聚释放;异硫氰酸胍属于强力的蛋白质变性剂,可溶解蛋白质并使其二级结构消失,裂解细胞,使核蛋白与核酸分离。②胍盐/β-巯基乙醇法:胍盐使细胞充分裂解,β-巯基乙醇属于蛋白质变性剂,可以抑制RNase活性,保护RNA不被降解。

    RNA的提取纯化可以采取沉淀法或吸附法,吸附的材料包括阴离子交换树脂、硅基质和磁珠。①沉淀法步骤:抽提→沉淀→洗涤→RNA沉淀溶解。②吸附柱试剂盒步骤:吸附柱结合→去蛋白液和DNase处理→漂洗→RNA洗脱收集。

    RNA的检测可以采取紫外分光光度计、琼脂糖电泳和荧光定量PCR。①紫外分光光度计:得率=OD260×稀释倍数×40 ng/μl;纯度可以通过OD260/OD280的比值进行计算,通常情况下比值在1.9~2.1,代表RNA纯度高。②琼脂糖电泳:通常采用1%的琼脂糖凝胶,上样200~1000 ng,高质量的RNA会在5kb和2kb的位置分别看到28s和18s rRNA,并且18s rRNA条带的亮度是28s rRNA的一半。③荧光定量PCR:通过扩增曲线判断RNA的质量。


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