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骨组织工程材料设计策略

2021-08-01

      成功的骨组织工程材料设计需要了解天然骨组织的组成和结构,以及适当选择仿生天然或可调谐合成材料(生物材料),如聚合物、生物陶瓷、金属和复合材料。可扩展的制造技术能够控制多个长度尺度的结构,包括三维打印和电场辅助技术,然后可以用来加工这些生物材料,使其成为适合骨组织工程的形式。 骨组织工程的目标      骨组织工程研究领域的目标是设计出优于自体骨和同种异体骨的材料,即设计可以植入骨缺损处的材料,然后利用患者自身的细胞重塑。这些材料通常以支架的形式作为细胞附着和矿化基质沉积的支持结构,在修复初期在形成组织中履行细胞外基质的作用。根据缺损部位以及患者个体情况,需要应用不同的结构和功能材料,以实现所选策略的有效性。骨组织工程材料的设计应基于健康骨组织的特征,这些特征决定了其功能,包括促进细胞和血管浸润的多孔结构、骨组织结构的各层次特异性等。 骨组织工程材料      各种类型的材料及其组合被作为具有骨组织工程应用前景的候选材料。一般来说,骨组织工程材料的选择需要考虑多种因素,具体包括预期的制造和实施策略。鉴于天然骨组织的有机和无机组成,骨组织工程应用中最常见的生物材料是聚合物、生物陶瓷和复合材料。除此之外,细胞和/或生物活性分子也可能包括在骨组织工程的材料系统。 骨组织工程材料的制备技术      除了材料特性和合成策略可决定生物材料的基本作用外,制造技术也能决定其广泛的性能,包括形态(例如孔隙结构)、理化学性质(例如降解)、机械性能(例如压缩模量)和生物学性质(例如细胞浸润)等。制造技术的选择取决于所需生物材料的形式和结构以及影响材料加工的因素。根据预期的应用和策略,常用材料可以被制成微粒或纳米粒子、纤维、凝胶、涂层、薄膜和3D结构。基于乳化液的技术是最常见的颗粒形成方法,而涂层和膜的制备通常使用浸涂、物理气相沉积、化学气相沉积和逐层沉积。 临床因素      组织工程材料的设计依赖于以下三方面的清晰理解:缺损部位、最终用户需求和材料旨在解决的功能缺陷。例如长骨和颅面部位的骨缺损对患者生活质量的影响都很严重但影响的方面又不同,因此每个临床应用的具体要求必须在设计之初就确定。      除了考虑骨缺损的部位和尺寸,患者的年龄和身体状况也影响骨再生的成功与否,在材料设计早期也应考虑到。创伤性损伤或外科肿瘤切除导致的骨缺损以及感染性骨缺损,骨组织工程材料系统应分别提供抗肿瘤或抗菌药物,,促进系统与天然组织的良好整合。       尽管骨组织工程生物材料的应用取得了相当大的进展,但仍存在挑战阻碍了进一步的临床转化,其中之一就是研究者对大多数生物材料的作用机制和由此产生的细胞反应的了解还有限,解决这一需求需要系统的研究。 Koons, G.L., Diba, M. & Mikos, A.G. Materials design for bone-tissue engineering. Nat Rev Mater 5, 584–603 (2020). https://doi.org/10.1038/s41578-020-0204-2

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MicroRNA与lncRNA研究专题

2021-07-27

1 miRNA生物生成      首先在细胞核中,编码miRNA的基因在RNA聚合酶的作用下转录成长度约为几千个碱基的5’端具有甲基化鸟嘌呤和3’端具有初级转录本pri-miRNA,其发卡结构会被DROSHA-DGCR8 核微处理器复合体切割。DROSHA-DGCR8 核微处理器复合体是由一个RNaseIII酶RNASEN (Drosha)分子和两个DiGeorge关键区域8(DGCR8)分子组成的364 kDa异三聚体。DROSHA与DGCR8中的23个氨基酸肽一起构成了一个最小的功能核心,DROSHA充当了“标尺”的作用,识别pri-mRNA较低一端的ssRNA-dsRNA的结合点,从连接处测量11 bp的距离;DGCR8识别pri-miRNA发夹上茎和顶端元件,并招募Drosha剪切双链RNA产生含有60-70 nt具有茎环结构的前体miRNA(pre-miRNA)。研究表明,DGCR8具有3个不同功能的组成部分:尾巴稳定了DROSHA,主体通过招募pri-miRNA提高加工效率,头部可以识别pri-miRNA上游元件(包括UGUG)确保加工的精确度。      Pre-miRNA在Ran-GTP/Exportin 5协助下从细胞核输出,到达细胞质中被Dicer核糖核酸内切酶识别并对茎环结构进行剪切和修饰,形成双链miRNA。最后,双链miRNA被装载进Argonaute(Ago),形成RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC),双链中成熟的miRNA(guide strand,向导链)保持和Ago蛋白的结合,另一条链(passenger strand)则排出复合物并迅速降解。 2 miRNA功能      当RISC复合体与miRNA结合后,便可进行mRNA的识别。MicroRNA主要具有以下功能①翻译抑制:在大多数情况下,成熟miRNA与靶基因mRNA 的3’端非编码区通过6-7个碱基互补结合,可导致miRNA在蛋白质翻译水平上抑制靶基因的表达;②mRNA降解:当miRNA与靶位点完全互补,可引起mRNA的降解(在植物中比较常见),通过这种机制作用的miRNA的结合位点往往位于mRNA的编码区或者开放阅读框。 参考文献:[1] Nguyen TA, Jo MH, Choi YG, Park J, Kwon SC, Hohng S, Kim VN, Woo JS. Functional Anatomy of the Human Microprocessor[J]. Cell, 2015,161(6):1374-87.  3 lncRNA生物合成      RNA聚合酶Ⅱ转录的大多数LncRNA被低效加工并保留在细胞核内,其它的被剪接并输出到细胞质中。包含一个或几个外显子的LncRNA通过核RNA输出因子1( nuclear RNA export factor 1,NXF1) 4 lncRNA功能      lncRNA能够在多个水平调控基因表达:通过与DNA、RNA和蛋白质相互作用,调控染色质的结构和功能,以及近端和远端基因的转录,影响RNA的剪接、稳定和翻译。此外,lncRNA参与细胞器和核凝聚物的形成和调节。4.1 lncRNA的基因调控      ①染色质调节:RNA负电荷可以中和组蛋白的正电荷进而导致染色质松散,因此,RNA介导的染色质的开放性和闭合性可能起到基因表达快速装换的作用。机制上,顺式作用和反式作用的细胞核lncRNA都与DNA建立相互作用,从而改变染色质环境,有时是间接通过他们与蛋白质的亲和性,这些蛋白质能够与DNA和RNA结合,有时是通过序列特异性的方式结合DNA。      ②蛋白质-lncRNA在染色质上的定位和功能:大量的lncRNA定位在染色质上可以与蛋白质相互作用,促进或者抑制蛋白质在目标DNA区域的结合和活性      ③lncRNA与DNA之间的直接相互作用:lncRNA的一个基本特征是能够与产生杂交结构,从而影响染色质的可及性。这种相互作用可以采取三重螺旋或者R环。      ④转录调节:lncRNA与其邻近基因之间的相对位置是其调控关系的关键决定因素。      ⑤基因沉默:目前已知的lncRNA介导的基因抑制机制与基因剂量补偿有关,这种功能的代表是lncRNA XIST,这是雌性哺乳动物细胞中X染色体失活的原因。在其它的位点,顺式lncRNA可以直接或者间接地与邻近转录位点的染色质相互作用促进非活性染色质状态。lncRNA还可以通过干扰转录机制来抑制基因表达。      ⑥增强子上转录的lncRNA:活性增强子可以转录成两种主要的非编码RNAs:eRNAs和增强子相关LncRNA(enhancer-associated lncRNAs,elncRNAs)。虽然增强子活性和eRNA表达之间的相关性已经建立,但eRNA转录本本身是否具有功能仍存在争议。elncRNA的剪接与其相关增强子的活性正相关,并与邻近蛋白编码基因的丰度相关;elncRNA可以与染色质调节蛋白合作调节染色质结构和拓扑      ⑦涉及顺式lncRNA的调控网络:lncRNA对顺式基因的调控不仅是由lncRNA对邻近基因一对一的效应决定的,lncRNA是复杂调控单元的一部分,在这个单元中,一个蛋白编码基因的表达可能受到两个或者多个lncRNA以及转录依赖性和转录非依赖性之间的协同调节。 4.2 转录后调控      lncRNA在基因表达方面也起着调控作用,有些lncRNA会被翻译成功能肽。但是,lncRNA主要是通过蛋白质与核酸建立相互作用的能力发挥作用。      ①lncRNA与蛋白质直接相互作用的模式:lncRNA通过与RNA序列座或结构结合形成特定的lncRNA-蛋白复合物(lncRNPs),从而参与转录后调控,导致mRNA剪接和转换的改变,在某些生物学背景下,还参与信号通路的调节。      ②与其他RNA配对以招募蛋白质复合物:部分lncRNA可以直接与其他RNA进行碱基配对,随后招募参与mRNA降解的蛋白。      ③miRNA海绵:部分含有miRNA互补位点的lncRNA可以作为竞争性内源RNA或miRNA“海绵”调控基因的表达,从而减少靶向mRNA的miRNA的可获得性。      ④调节细胞器功能:大量的lncRNA定位于外泌体、线粒体等特定的细胞器。外泌体定期释放到细胞外环境,lncRNA也会随之进入受体细胞,在受体细胞中参与表观遗传控制、细胞类型重编程。线粒体中的lncRNA,通常与线粒体代谢、细胞凋亡等有关。 参考资料:[2]Statello L, Guo CJ, Chen LL, Huarte M. Gene regulation by long non-coding RNAs and its biological functions[J]. Nat Rev Mol Cell Biol,2021,22(2):96-118.  5 MicroRNA和lncRNA的数据库及分析5.1 microRNA数据库miRBase是最著名的miRNA数据库之一,能够在发表前为新的miRNA提供唯一的名称,miRBase可以提供广泛的功能注释、实验证据以及与其它数据库的链接。DIANA-TarBase最初发布于2006年,它是第一个旨在编目发表的已验证的miRNA:mRNA基因相互作用的数据库,使用DIANA-TarBase可以轻松识别阳性或阴性实验结果,所使用的实验方法、实验条件。Rfam包含大量关于miR家族的信息,包括序列、二级结构(通常是预测的)等。 当研究某一基因是否为miRNA的调控靶点时,可利用miRanda、TargetScan、Pic TAR等算法进行预测。 5.2 lncRNA数据库ChIPBase:提供lncRNA的表达图谱和转录调控的鉴定和注释,整合了高通量RNA-seq鉴定的lncRNA及其表达图谱、ChIP-Seq实验技术鉴定的转录因子结合位点。除此之外,lncRNA的数据库主要有lncRNAdb、LncRNADisease、RNAcentral等,提供对lncRNA的注释,但是,很少有lncRNA具有实验确定的功能,许多只是通过计算预测出来的。随着更多lncRNA功能相关生物学信息的出现,可用的网站和工具将会有相当大的变化。  参考文献:[3] Sun X , Gribskov M . MicroRNA and lncRNA Databases and Analysis [J]. Encyclopedia of Bioinformatics and Computational Biology, 2019, 2:165-170.

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MicroRNA课题设计策略

2021-07-26

    涉及miRNA的研究主要是建立miRNA、作用靶点和生物学功能之间的关系,三者都可作为切入点展开研究,本次js333国际线路检测介绍从目标miRNA开始的常用研究策略。(1)寻找目的miRNA① miRNA qRT-PCR检测    在病理组织、血液等样本中准确检测候选miRNA的表达谱,可有助于分析miRNA与疾病等条件的相关性,用于开发miRNA作为生物标志物;进一步,也可以寻找miRNA变化影响的靶基因表达变化。② miRNA表达芯片谱检测    MicroRNA芯片检测服务是检测样本总RNA中miRNA表达谱,筛选出差异表达共表达的miRNA。(2)预测靶基因以及靶基因功能    MicroRNA与靶基因的相互作用可以通过targetscan(http://www.targetscan.org/)、miRDB(http://mirdb.org/miRDB/)、miRWalk(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)等数据库进行预测。不同的数据库的计算方法存在差异,可以结合多个数据库的结果进行预测。预测到下游靶基因后,可以结合DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)进一步了这些基因所涉及的功能以及信号通路。(3)确定靶关系以及miRNA功能    体外实验中,利用qRT-PCR、荧光素酶报告质粒、RIP-Seq等方法,在改变miRNA丰度的情况下验证所预测的靶基因,确定其是否为miRNA的真实靶点;观察细胞表型变化,例如增殖、凋亡、侵袭转移等,和基因的表达分析相结合。    进一步,通过体内实验,构建功能获得(gain of function,GOF)和功能失活(loss of function,LOF)动物模型,利用miRNA agomir或者miRNA antagomir等调节动物体miRNA表达水平,从而验证其作用机制。    研究也可以从感兴趣的基因出发,寻找确定以该基因为靶向的miRNA,最后判断其功能;也同时,也可以将特殊的功能或者表型作为切入点,进而筛选引起这些变化的miRNA或者基因,最后寻找引起这些变化的基因或者miRNA。无论选择哪个切入点,研究最终的目的都是要阐明miRNA-靶基因-功能三者之间的关系。

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