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MicroRNA与lncRNA研究专题

2021-07-27

1 miRNA生物生成      首先在细胞核中,编码miRNA的基因在RNA聚合酶的作用下转录成长度约为几千个碱基的5’端具有甲基化鸟嘌呤和3’端具有初级转录本pri-miRNA,其发卡结构会被DROSHA-DGCR8 核微处理器复合体切割。DROSHA-DGCR8 核微处理器复合体是由一个RNaseIII酶RNASEN (Drosha)分子和两个DiGeorge关键区域8(DGCR8)分子组成的364 kDa异三聚体。DROSHA与DGCR8中的23个氨基酸肽一起构成了一个最小的功能核心,DROSHA充当了“标尺”的作用,识别pri-mRNA较低一端的ssRNA-dsRNA的结合点,从连接处测量11 bp的距离;DGCR8识别pri-miRNA发夹上茎和顶端元件,并招募Drosha剪切双链RNA产生含有60-70 nt具有茎环结构的前体miRNA(pre-miRNA)。研究表明,DGCR8具有3个不同功能的组成部分:尾巴稳定了DROSHA,主体通过招募pri-miRNA提高加工效率,头部可以识别pri-miRNA上游元件(包括UGUG)确保加工的精确度。      Pre-miRNA在Ran-GTP/Exportin 5协助下从细胞核输出,到达细胞质中被Dicer核糖核酸内切酶识别并对茎环结构进行剪切和修饰,形成双链miRNA。最后,双链miRNA被装载进Argonaute(Ago),形成RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC),双链中成熟的miRNA(guide strand,向导链)保持和Ago蛋白的结合,另一条链(passenger strand)则排出复合物并迅速降解。 2 miRNA功能      当RISC复合体与miRNA结合后,便可进行mRNA的识别。MicroRNA主要具有以下功能①翻译抑制:在大多数情况下,成熟miRNA与靶基因mRNA 的3’端非编码区通过6-7个碱基互补结合,可导致miRNA在蛋白质翻译水平上抑制靶基因的表达;②mRNA降解:当miRNA与靶位点完全互补,可引起mRNA的降解(在植物中比较常见),通过这种机制作用的miRNA的结合位点往往位于mRNA的编码区或者开放阅读框。 参考文献:[1] Nguyen TA, Jo MH, Choi YG, Park J, Kwon SC, Hohng S, Kim VN, Woo JS. Functional Anatomy of the Human Microprocessor[J]. Cell, 2015,161(6):1374-87.  3 lncRNA生物合成      RNA聚合酶Ⅱ转录的大多数LncRNA被低效加工并保留在细胞核内,其它的被剪接并输出到细胞质中。包含一个或几个外显子的LncRNA通过核RNA输出因子1( nuclear RNA export factor 1,NXF1) 4 lncRNA功能      lncRNA能够在多个水平调控基因表达:通过与DNA、RNA和蛋白质相互作用,调控染色质的结构和功能,以及近端和远端基因的转录,影响RNA的剪接、稳定和翻译。此外,lncRNA参与细胞器和核凝聚物的形成和调节。4.1 lncRNA的基因调控      ①染色质调节:RNA负电荷可以中和组蛋白的正电荷进而导致染色质松散,因此,RNA介导的染色质的开放性和闭合性可能起到基因表达快速装换的作用。机制上,顺式作用和反式作用的细胞核lncRNA都与DNA建立相互作用,从而改变染色质环境,有时是间接通过他们与蛋白质的亲和性,这些蛋白质能够与DNA和RNA结合,有时是通过序列特异性的方式结合DNA。      ②蛋白质-lncRNA在染色质上的定位和功能:大量的lncRNA定位在染色质上可以与蛋白质相互作用,促进或者抑制蛋白质在目标DNA区域的结合和活性      ③lncRNA与DNA之间的直接相互作用:lncRNA的一个基本特征是能够与产生杂交结构,从而影响染色质的可及性。这种相互作用可以采取三重螺旋或者R环。      ④转录调节:lncRNA与其邻近基因之间的相对位置是其调控关系的关键决定因素。      ⑤基因沉默:目前已知的lncRNA介导的基因抑制机制与基因剂量补偿有关,这种功能的代表是lncRNA XIST,这是雌性哺乳动物细胞中X染色体失活的原因。在其它的位点,顺式lncRNA可以直接或者间接地与邻近转录位点的染色质相互作用促进非活性染色质状态。lncRNA还可以通过干扰转录机制来抑制基因表达。      ⑥增强子上转录的lncRNA:活性增强子可以转录成两种主要的非编码RNAs:eRNAs和增强子相关LncRNA(enhancer-associated lncRNAs,elncRNAs)。虽然增强子活性和eRNA表达之间的相关性已经建立,但eRNA转录本本身是否具有功能仍存在争议。elncRNA的剪接与其相关增强子的活性正相关,并与邻近蛋白编码基因的丰度相关;elncRNA可以与染色质调节蛋白合作调节染色质结构和拓扑      ⑦涉及顺式lncRNA的调控网络:lncRNA对顺式基因的调控不仅是由lncRNA对邻近基因一对一的效应决定的,lncRNA是复杂调控单元的一部分,在这个单元中,一个蛋白编码基因的表达可能受到两个或者多个lncRNA以及转录依赖性和转录非依赖性之间的协同调节。 4.2 转录后调控      lncRNA在基因表达方面也起着调控作用,有些lncRNA会被翻译成功能肽。但是,lncRNA主要是通过蛋白质与核酸建立相互作用的能力发挥作用。      ①lncRNA与蛋白质直接相互作用的模式:lncRNA通过与RNA序列座或结构结合形成特定的lncRNA-蛋白复合物(lncRNPs),从而参与转录后调控,导致mRNA剪接和转换的改变,在某些生物学背景下,还参与信号通路的调节。      ②与其他RNA配对以招募蛋白质复合物:部分lncRNA可以直接与其他RNA进行碱基配对,随后招募参与mRNA降解的蛋白。      ③miRNA海绵:部分含有miRNA互补位点的lncRNA可以作为竞争性内源RNA或miRNA“海绵”调控基因的表达,从而减少靶向mRNA的miRNA的可获得性。      ④调节细胞器功能:大量的lncRNA定位于外泌体、线粒体等特定的细胞器。外泌体定期释放到细胞外环境,lncRNA也会随之进入受体细胞,在受体细胞中参与表观遗传控制、细胞类型重编程。线粒体中的lncRNA,通常与线粒体代谢、细胞凋亡等有关。 参考资料:[2]Statello L, Guo CJ, Chen LL, Huarte M. Gene regulation by long non-coding RNAs and its biological functions[J]. Nat Rev Mol Cell Biol,2021,22(2):96-118.  5 MicroRNA和lncRNA的数据库及分析5.1 microRNA数据库miRBase是最著名的miRNA数据库之一,能够在发表前为新的miRNA提供唯一的名称,miRBase可以提供广泛的功能注释、实验证据以及与其它数据库的链接。DIANA-TarBase最初发布于2006年,它是第一个旨在编目发表的已验证的miRNA:mRNA基因相互作用的数据库,使用DIANA-TarBase可以轻松识别阳性或阴性实验结果,所使用的实验方法、实验条件。Rfam包含大量关于miR家族的信息,包括序列、二级结构(通常是预测的)等。 当研究某一基因是否为miRNA的调控靶点时,可利用miRanda、TargetScan、Pic TAR等算法进行预测。 5.2 lncRNA数据库ChIPBase:提供lncRNA的表达图谱和转录调控的鉴定和注释,整合了高通量RNA-seq鉴定的lncRNA及其表达图谱、ChIP-Seq实验技术鉴定的转录因子结合位点。除此之外,lncRNA的数据库主要有lncRNAdb、LncRNADisease、RNAcentral等,提供对lncRNA的注释,但是,很少有lncRNA具有实验确定的功能,许多只是通过计算预测出来的。随着更多lncRNA功能相关生物学信息的出现,可用的网站和工具将会有相当大的变化。  参考文献:[3] Sun X , Gribskov M . MicroRNA and lncRNA Databases and Analysis [J]. Encyclopedia of Bioinformatics and Computational Biology, 2019, 2:165-170.

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MicroRNA课题设计策略

2021-07-26

    涉及miRNA的研究主要是建立miRNA、作用靶点和生物学功能之间的关系,三者都可作为切入点展开研究,本次js333国际线路检测介绍从目标miRNA开始的常用研究策略。(1)寻找目的miRNA① miRNA qRT-PCR检测    在病理组织、血液等样本中准确检测候选miRNA的表达谱,可有助于分析miRNA与疾病等条件的相关性,用于开发miRNA作为生物标志物;进一步,也可以寻找miRNA变化影响的靶基因表达变化。② miRNA表达芯片谱检测    MicroRNA芯片检测服务是检测样本总RNA中miRNA表达谱,筛选出差异表达共表达的miRNA。(2)预测靶基因以及靶基因功能    MicroRNA与靶基因的相互作用可以通过targetscan(http://www.targetscan.org/)、miRDB(http://mirdb.org/miRDB/)、miRWalk(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)等数据库进行预测。不同的数据库的计算方法存在差异,可以结合多个数据库的结果进行预测。预测到下游靶基因后,可以结合DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)进一步了这些基因所涉及的功能以及信号通路。(3)确定靶关系以及miRNA功能    体外实验中,利用qRT-PCR、荧光素酶报告质粒、RIP-Seq等方法,在改变miRNA丰度的情况下验证所预测的靶基因,确定其是否为miRNA的真实靶点;观察细胞表型变化,例如增殖、凋亡、侵袭转移等,和基因的表达分析相结合。    进一步,通过体内实验,构建功能获得(gain of function,GOF)和功能失活(loss of function,LOF)动物模型,利用miRNA agomir或者miRNA antagomir等调节动物体miRNA表达水平,从而验证其作用机制。    研究也可以从感兴趣的基因出发,寻找确定以该基因为靶向的miRNA,最后判断其功能;也同时,也可以将特殊的功能或者表型作为切入点,进而筛选引起这些变化的miRNA或者基因,最后寻找引起这些变化的基因或者miRNA。无论选择哪个切入点,研究最终的目的都是要阐明miRNA-靶基因-功能三者之间的关系。

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2022年度浙江省自然科学基金-js333国际线路检测联合基金申请工作已经全面启动

2021-06-22

  根据《浙江省科学技术厅 浙江省自然科学基金委员会关于开展2022年度浙江省基础公益研究专项申报工作的通知》(以下简称《通知》),2022年度浙江省自然科学基金-js333国际线路检测联合基金(以下简称省基金-北京中卫联合基金)的申请工作已经全面启动,现将注意事项和主要工作安排通知如下:一、区域创新发展联合基金介绍    为深化完善基础研究多元化投入机制,浙江省自然科学基金与浙江省药学会、中国电建集团华东勘测设计研究院有限公司、js333国际线路检测、台州市政府、衢州市政府、浙江省水利厅设立浙江省自然科学基金联合基金。二、省基金-北京中卫联合基金资助方向2.1 重点项目资助方向-人口与健康领域   (1)胃癌卵巢转移的机制研究(申请代码选择H16的下属代码)针对胃癌卵巢转移关键机制仍不明确,治疗效果及预后差等问题,利用单细胞测序、模式动物模型等技术手段,开展胃癌卵巢转移关键基因及可能机制研究,寻找基于肿瘤调控的干预靶点,同时通过临床样本验证。实现胃癌卵巢转移发生发展机制关键科学问题的突破。   (2)蕈样霉菌病(皮肤淋巴瘤)发生发展相关机制研究(申请代码选择H16的下属代码)围绕蕈样霉菌病独特的病程发展规律与生物学行为,围绕其肿瘤微环境、免疫细胞调节等领域开展机制研究,寻找肿瘤调控的干预途径,实现对蕈样霉菌病发生发展机制关键科学问题的突破。   (3)基于微量金属离子基体系的腱-骨愈合机制研究(申请代码选择H18的下属代码)基于微量金属离子的梯度变化,促进肩袖组织梯度重建和一体化再生的关键技术研究,并基于此技术构建有临床应用前景微量金属离子基体系。申报人员及单位基本要求:    方向(1)(2)对全省依托单位开放,申报单位须与省内省级以下医疗卫生机构(不含省级,下同)合作申报(省级以下医疗卫生机构牵头申报的除外),且省内省级以下医疗机构人员须为项目主要参与人(排名前三,含项目负责人);方向(3)对省内省级以下医疗卫生机构(须为省基金依托单位,不包含省级医疗卫生单位,以浙江省卫生健康委员会网站https://wsjkw.zj.gov.cn/为准)开放;具有临床工作经验的申请人(需在申请书正文“工作基础”部分做出文字声明)同等条件下优先资助。2.2 探索项目资助方向-人口与健康领域  (1)具有地区特色的浙派中医传统理论和技术的机制探索研究(申请代码选择H27的下属代码)围绕温病学派和针灸学派的传统医学理论、蜂疗等传统医学技术在新环境下的开拓创新,特别是针对自体免疫类疾病(如溃疡性结肠炎)、老年退行性疾病(骨关节炎等)的应用创新和机制探索。  (2)具有地区特色的畲族医药传统理论及药材相关的机制探索研究(申请代码选择H27或H28的下属代码)围绕畲族医药的道地药材、传统理论及验方在新环境下的开拓创新,特别是针对肿瘤、自体免疫性疾病、肝脏疾病的应用创新和机制探索。   (3)自愈合可注射水凝胶技术在骨科领域应用的作用与机制探索研究(申请代码选择H18的下属代码)针对骨科常见的缺损修复应用场景,设计自愈合、低毒性或无毒性、可注射、可诱导成骨的水凝胶材料,并对其体内作用效果及机制进行探究。   (4)肠缺血再灌注中肠道屏障损伤及药物保护机制研究(申请代码选择H03的下属代码)围绕肠缺血再灌注过程中氧化应激、细胞凋亡过程,探索其发生发展机制以及药物作用靶点和保护机制,寻找药物治疗的干预途径。   (5)胆管炎肝脏损伤发生机制及治疗策略研究(申请代码选择H03的下属代码)针对临床急性重症胆管炎常伴随的肝脏损伤情况,探索肝脏损伤发生发展机制,探索调控通路及关键靶点,寻找治疗新途径。   (6)基于生物医用高分子材料的诊疗体系构建研究(申请代码选择H18的下属代码)利用仿生层状组装技术、生物功能化纳米材料等技术,围绕损伤修复、疾病靶向诊疗等临床问题,重点探究基于功能导向的高分子材料设计、性能调控、作用机制的应用基础科学问题。   (7)临床标志物高精度检测研究(申请代码选择H18或H20的下属代码)围绕肿瘤、心血管疾病等精准诊治需求,寻找特异性标志物并建立灵敏度高、特异性强的快速检测方法为精准医学提供技术支撑。申请人员及单位基本要求    方向(1)(2)(3)对全省依托单位开放,申请单位须与省内省级以下医疗卫生机构合作申报(省内省级以下医疗卫生机构牵头申报的除外),且省内省级以下医疗卫生机构人员须为项目主要参与人(排名前三,含项目负责人);方向(4)(5)(6)(7)对省内省级以下医疗卫生机构(须为省基金依托单位,不包含省级医疗卫生单位,以浙江省卫生健康委员会网站https://wsjkw.zj.gov.cn/为准)开放。具有临床工作经验的申请人(需在申请书正文“工作基础”部分做出文字声明)同等条件下优先资助。 三、申报方式和时间安排   (一)网络申报。2022年度基础公益研究专项采用网络在线填报方式,申请人请通过浙江省政务服务网进行网络申报(网址:www.zjzwfw.gov.cn/zjservice/item/detail/index.do?impleCode=ff8080815d551320015d58a5a2f200222331001216001&webId=1),点击“在线办理”,用政务服务网账号登录申报项目。申报须知请参看http://zjnsf.kjt.zj.gov.cn/portal/detail.html?typeid=2018915&postid=852859257396133888。   (二)审核推荐。各依托单位应做好项目申报的服务指导,并对项目进行审核,在规定时间内做好组织申报和审核上报工作。各高校附属医院统一由归口高校审核。      (三)填报时间。本次网上申报从2021年7月6日开始,申报和审核推荐截止时间分别为7月25日、7月30日,请申请人和依托单位妥善安排申报和审核时间。 四、咨询方式   js333国际线路检测:王老师,0571-85333229

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